2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、CD1d是一種MHCI類分子類似物,與MHCI類分子主要提呈抗原肽不同,CD1d主要提呈脂類、糖脂類抗原給自然殺傷性T細胞(NKT)。作為NKT細胞的配體,CD1d多聚體為NKT細胞的相關研究提供了鑒定與功能調控的手段。本研究擬制備人CD1d二聚體(hCD1d二聚體),為后續深入研究NKT細胞奠定基礎。本研究主要內容包括:
 ?、舙FastBacTMDual+[β2m+CD1d/IgG1-Fc]昆蟲桿狀病毒表達載體的構建。為了構建

2、pFastBacTMDual+[β2m+CD1d/IgG1-Fc]表達質粒,選用本課題組前期已經建立的pFastBacTMDual+[β2m]質粒作為載體,該載體中P10啟動子下游已經重組入正確的人β2m編碼基因。應用人CD1d及IgG1-Fc特異性引物分別從人PBMC中擴增hCD1d(α1-α3)與IgG1-Fc(CH1-CH3區)編碼基因。通過酶切位點將hCD1d與 IgG1-Fc融合基因插入到 pFastBacTMDual+[β2

3、m] Ph啟動子下游,獲得pFastBacTMDual+[β2m+CD1d/IgG1-Fc]表達質粒。經過特異性引物PCR、限制性內切酶酶切和DNA堿基序列測定證實構建的質粒正確插入了目的基因。
 ?、苃CD1d二聚體的表達及鑒定。將攜帶目的基因的pFastBacTMDual+[β2m+CD1d/IgG1-Fc]質粒通過轉座作用轉入桿狀病毒載體,并轉染到草地貪夜蛾sf9細胞中。轉染后5天收集細胞培養上清,此上清中含有可表達hCD1

4、d二聚體的桿狀病毒顆粒。利用此上清繼續感染細胞,對感染每一代病毒的細胞上清進行hCD1d二聚體水平檢測,結果顯示感染第四代病毒的細胞上清中hCD1d二聚體表達量最高。收集感染第四代病毒的細胞上清,用特異性的抗體進行ELISA及Western-Blot檢測鑒定。結果證實獲得具有正確構象與分子量的hCD1d二聚體。
 ?、莌CD1d二聚體的純化。由于hCD1d二聚體含有IgG1-Fc片段,本研究利用金黃色葡萄球菌蛋白A(SPA)對hC

5、D1d二聚體進行純化。然而實驗顯示傳統的洗脫液(pH4.5的0.1M甘氨酸)不能有效的洗脫hCD1d二聚體。比較pH2.5的0.1M甘氨酸、pH2.5的0.5M甘氨酸、pH2.5的1M甘氨酸、pH2.5的0.1M乙酸、pH1.9的0.1M鹽酸和pH2.5的0.1M檸檬酸等六種不同洗脫液洗脫效果,結果顯示pH2.5的0.1M檸檬酸洗脫能夠較好的濃縮純化hCD1d二聚體。
 ?、菻LA-A2二聚體與hCD1d二聚體在純化過程中的構象穩

6、定性分析。HLA-A2為經典MHC I類分子,本室之前構建表達的HLA-A2二聚體是HLA-A2與IgG1-Fc的融合蛋白。通過比較HLA-A2二聚體與hCD1d二聚體在純化過程中構象的改變,發現在SPA親和層析過程中,大部分純化的hCD1d二聚體中hCD1d與β2m可以維持完整構象(完整構象率%:71.4%±30.1%,n=3),而大部分純化的HLA-A2二聚體中β2m脫落、導致構象改變(完整構象率%:13.7%±13.7%,n=2)

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